Control de los Microorganismos

Los microorganismos ofrecen diversos beneficios a la sociedad en diferentes formas. En otro aspecto son también los microorganismos un vehículo para la producción de enfermedades, por la producción de toxinas propiamente dichas o metabolitos tóxicos. Además de daños en cultivos, descomposición de alimentos y enfermedades en animales. Es por esto que el ser humano ha buscado los procedimientos necesarios para destruir o controlar el crecimiento de los microorganismos perjudiciales.

DEFINICIONES IMPORTANTES:

- Muerte microbiana: Pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse.

- Esterilización: Proveniente del latín sterilis “incapaz de reproducirse”. Proceso por el cual las células vivas, esporas viables, virus y viroides destruidos o eliminados de un objeto o hábitat.

- Desinfección: Destrucción, eliminación o inhibición de los microorganismos que pueden producir enfermedad de una superficie u objeto. Se mantienen viables las esporas.

- Germicida: Terminación _cida del latín que significa “destruir”. Es un agente que puede destruir microorganismos patógenos y muchos no patógenos pero no necesariamente esporas. (Bactericida, fungicida, viricida)

- Terminación _statico: proveniente del griego statikos “que causa detención”, agente con capacidad de inhibir el crecimiento microbiano, pero sin matarlos. (Bacteriostático, fungistático)

Condiciones que influyen en la eficacia de un antimicrobiano:

La destrucción de los microorganismos y la inhibición del crecimiento no es un proceso simple, debido a que la eficacia de un agente antimicrobiano es afectada por 6 factores:

1. Tamaño de la población: Debido a que la muerte es exponencial, una población muy grande requiere de mayor tiempo.

2. Composición de la población: la eficiencia del antimicrobiano varía considerablemente con respecto a la naturaleza de los organismos que son tratados porque su susceptibilidad es distinta. Por ejemplo: las endosporas bacterianas son más resistentes que las células vegetativas, las células jóvenes mueren con mayor facilidad y algunas especies soportan mejor condiciones adversas.

3. Concentración o intensidad del agente antimicrobiano: A menudo, pero no siempre, entre mayor sea la concentración del agente químico o más intenso agente físico, más rápidamente se destruyen los microorganismos. Pero generalmente la eficiencia no está relacionada con la concentración o intensidad. (alcohol)

4. Tiempo de exposición: cuanto más tiempo se exponga una población a un determinado agente, más organismos se destruirán.

5. Temperatura: A menudo, un aumento en la temperatura aumenta la actividad de un agente químico.

6. Entorno: la población que se quiere destruir no se encuentra aislada, está rodeada de diversos factores ambientales que pueden protegerla o facilitar su destrucción. Por ejemplo: el calor es más efectivo en un medio ácido, la materia orgánica les da protección contra el calor y los desinfectantes químicos.

Modo de acción de los antimicrobianos:

- Alteración de la permeabilidad de la membrana citoplasmática

- Daño a la pared celular o inhibición de la síntesis de sus componentes

- Alteración del estado físico químico de las proteínas y ácidos nucleicos, o inhiben su síntesis

- Inhibición enzimática

Procedimientos para el control microbiano:

- Métodos físicos

- Métodos químicos

- Agentes Antimicrobianos

MÉTODOS FÍSICOS: Los métodos físicos se utilizan a menudo para lograr la descontaminación, la desinfección y la esterilización microbiana.

CALOR: La exposición al agua en ebullición durante 10 minutos es suficiente para destruir células vegetativas, pero no es suficiente para destruir endosporas. No esteriliza.

La eficacia del calor como agente antimicrobiano, se puede expresar como el Tiempo de muerte térmico (TMT), que se define como el tiempo más corto necesario para destruir los microorganismos en una suspensión, a una temperatura específica y en condiciones definidas. Sin embargo como la destrucción es logarítmica no es posible eliminar completamente los microorganismos de una muestra.

Existen diversos métodos de control de microorganismos por medio del calor:

a. Esterilización por vapor (calor húmedo o autoclave): El agua es llevada a punto de ebullición de manera que el vapor llena la cámara, desplazando el aire frío. Cuando todo el aire es expulsado, se cierran las válvulas de seguridad y el vapor satura toda la cámara, por lo que incrementa la presión, hasta que se alcanzan los valores deseados (121°C y 15 lb presión).

En estas condiciones se destruyen todas las células vegetativas y endosporas en un tiempo que por lo general es de 15 minutos. Se piensa que el calor húmedo degrada los ácidos nucleicos, desnaturaliza proteínas y además alterar las membranas celulares.

Si no se cumplen las condiciones adecuadas, no hay esterilización. Para controlar el buen funcionamiento del equipo, se pueden incluir con la esterilización un control biológico o un indicador químico.

El indicador biológico consiste en una ampolla estéril con un medio y un papel cubierto con esporas de Bacillus stearothermophilus o Clostridium. Luego de la esterilización se rompe la ampolla y se incuba por unos días. El indicador químico consiste en una cinta especial con letras o líneas que cambian de color después del tratamiento suficiente con calor.

b. Pasteurización: Se utiliza para sustancias o medios que no pueden ser calentadas a más de su temperatura de ebullición.

Un calentamiento breve a 55 o 60°C destruirá los microorganismos patógenos y disminuye los causantes de la descomposición de la sustancia. NO esteriliza.

Existen variaciones que son utilizadas en la industria de la leche: la pasteurización rápida (HTST high temperature short-term) que consiste en calentar a 72°C por 15 segundos. Y la pasteurización a temperatura ultra elevada (UTH ultrahigh temperature) que calienta a 140-150°C por 1 a 3 segundos.

c. Tindalización o esterilización fraccionada al vapor: se utiliza para químicos o material biológico que no puede llevarse a más de 100°C. Se calienta a una temperatura de 90°C a 100°C durante 30 minutos por tres días consecutivos y se incuba a 37°C entra cada calentamiento.

El primer calentamiento destruye células vegetativas pero no esporas, por lo que germinan a 37ºC y luego son eliminadas con el siguiente calentamiento.

d. Calor seco: Se utilizan hornos o estufas a una temperatura de 160-170°C por 2 o 3 horas. Es menos efectivo que el calor húmedo, pero no corroe utensilios metálicos. Es lenta y no se puede utilizar para material termo sensible.

e. Incineración: Destruye por completo los microorganismos. (calentar las asas en los mecheros).

f. Temperaturas bajas: Refrigeración y congelación, son únicamente bacteriostáticos. En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo.

Esta circunstancia es aprovechada también por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

g. Desecación: Es de efecto bacteriostático y las esporas permanecen viables.

FILTRACIÓN: es utilizada para materiales termosensibles.

a. Filtros de profundidad: Se utilizan materiales fibrosos o granulados que forman una capa gruesa con canales de diámetro muy pequeño. La solución es aspirada al vacío y los microorganismos quedan retenidos o son adsorbidos por el material. Se utilizan diatomeas, porcelana no vidriada, asbestos.

b. Filtros de membrana: Son circulares con un grosor de 0.1 mm y con poros muy pequeños, de unos 2 μm por lo que los microorganismos no pueden atravesarlo. Se fabrican de acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sintéticos.

RADIACIÓN:

a. Ultravioleta: Es letal para todas las clases de microorganismos por su longitud de onda corta y su alta energía. Es letal a 260 nm ya que es la longitud de onda que es más efectivamente absorbida por el ADN.

El mecanismo primario del daño al ADN es la formación de dímeros de timina lo que inhibe su función y replicación. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

b. Ionizante: Niveles bajos pueden producir mutaciones e indirectamente resultar en la muerte, niveles altos son letales. Específicamente causan una serie de cambios en las células: ruptura de puentes de hidrógeno, oxidación de dobles enlaces, destrucción de anillos, polimerización de algunas moléculas, generación de radicales libres.

La mayor causa de muerte es la destrucción del ADN. Es excelente esterilizante y con penetración profunda en distintos materiales, por lo que se utilizan para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas desechables, sondas, etc.

No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes.

MÉTODOS QUÍMICOS:

Condiciones ideales para un agente antimicrobiano químico:

- No tóxico para el ser humano, animales ni medio ambiente

- Actividad antimicrobiana

- No debe de reaccionar con la materia orgánica o corroer

- Estable y homogéneo

Modo de acción:

- Bacteriostáticos: Inhibidores de síntesis proteica por unión al ribosoma, que es reversible, pues se disocia de este cuando disminuye en concentración.

- Bactericidas: Causa la muerte celular pero no la lisis. No se eliminan por dilución.

- Bacteriolíticos: Inducen la lisis celular al inhibir la síntesis de la pared celular o dañan la membrana citoplasmática.

Agentes antimicrobianos químicos:

a. Fenoles: El primer desinfectante y antiséptico utilizado, en 1867 Joseph Lister los empleó para reducir el riesgo de infección en las cirugías. Hasta ahora los fenoles y sus derivados (cresol, xilenol) son utilizados como desinfectantes en laboratorios y hospitales. Elimina micobacterias, eficaz aún en presencia de materia orgánica y permanece activo en la superficie después de mucho tiempo de su aplicación. Desnaturaliza proteínas y altera la membrana. Tiene olor desagradable y puede producir irritaciones cutáneas.

b. Alcoholes: No elimina esporas pero son bactericidas y fungicidas y algunas veces viricida (virus que contienen lípidos), son comúnmente utilizados principalmente el etanol y el isopropanol en concentraciones de 70-80%. Tienen el mismo modo de acción de los fenoles.

c. Metales pesados: mercurio, arsénico, plata, zinc y cobre. Son bacteriostáticos ya que el metal se combina con los grupos sulfihidrilos de las proteínas inactivándolas o precipitándolas. Son tóxicos. Ejemplos: sulfato de cobre (alguicida) y nitrato de plata (gonorrea oftálmica en niños)

d. Halógenos:

- Yodo: antiséptico cutáneo. Oxida componentes celulares y forma complejos con las proteínas. En altas concentraciones puede destruir algunas esporas. Puede lesionar la piel, dejar manchas y desarrollar alergias.

- Cloro: oxida componentes celulares, requiere un tiempo de exposición de unos 30 minutos.El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio, que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ión hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la célula a través de la membrana citoplasmática. En cambio, el ácido hipocloroso es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl2 ingresa como gas.

Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica, pues puede haber en el medio sustancias capaces de reaccionar con los compuestos clorados que disminuyan la concentración efectiva de éstos.

e. Compuestos cuaternarios de amonio (detergentes): Moléculas orgánicas emulsificantes porque contienen extremos polares y no polares, solubilizan residuos insolubles y son agentes limpiadores eficaces.
Solo los catiónicos son desinfectantes, alteran membrana y pueden desnaturalizar proteínas. No destruyen micobacterias ni esporas. Se inactivan con el agua dura y el jabón.

f. Aldehídos: Formaldehído y glutaraldehído, se combinan con las proteínas y las inactivan. Eliminan esporas (tras 12 horas de exposición) y pueden usarse como agentes esterilizantes.

g. Gases esterilizantes: Esterilización de objetos termosensibles.

- Oxido de etileno: microbicida y esporicida, se combina con las proteínas celulares. Alto poder penetrante. En concentraciones de 10-20% mezclado con CO2 o diclorodifluorometano. Se debe de airear ampliamente los materiales esterilizados para eliminar el gas residual porque es muy tóxico.

AGENTES ANTIMICROBIANOS:

La medicina moderna depende de los agentes quimioterapeuticos para el tratamiento de enfermedades. Estos agentes destruyen a los microorganismos patógenos o inhiben su crecimiento para evitar un daño significativo al hospedador.

La mayoría de estos agentes son antibióticos derivados de productos microbianos o sus derivados. Existen también antibióticos sintéticos. Características de los agentes antimicrobianos:

- Toxicidad selectiva: debe de eliminar o inhibir exclusivamente el microorganismo patógeno que está dañando al hospedador.

- No causar efectos adversos: No deben de causar efectos indeseables para el hospedador. (respuestas alérgicas, daño renal, daño gastrointestinal, nauseas, depleción de la médula ósea)

- Espectro de acción: Algunos agentes tienen un espectro de acción estrecho por lo que su efecto es contra una limitada variedad de microorganismos. Otros tienen un espectro de acción amplio, y pueden atacar diferentes clases de patógenos.

Para tener una idea de la efectividad de un agente antimicrobiano puede obtenerse:

- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que es la mínima concentración del agente antimicrobiano que puede inhibir el crecimiento de un patógeno en particular.

- Concentración Letal Mínima (CLM), es la mínima concentración de un agente antimicrobiano que mata a un patógeno.

Mecanismos de acción de los agentes antimicrobianos:

Las drogas antimicrobianas pueden causar un daño al organismo patógeno de varias maneras:

- Los antibióticos más selectivos son aquellos que interfieren con la síntesis de la pared bacteriana. (penicilinas, vancomicina, bacitracina, cefalosporinas).

- Pueden inhibir la síntesis proteica al unirse al ribosoma procariótico. (estreptomicina, gentamicina, cloranfenicol, eritromicina)

- Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos, inhibiendo la ADN girasa, interfiriendo con la replicación, transcripción o traducción, bloqueando la síntesis de ARN, etc. (ciprofloxacina, quinolonas, rifampicina)

- Daño en la membrana plasmática uniéndose a ella para dañar su estructura y alterar su permeabilidad. (polimixina B)

- Algunas drogas antimicrobianas pueden actuar como antimetabolitos: bloquean las vías metabólicas por competición inhibitoria. Compiten por los metabolitos.

Determinación del nivel de actividad antimicrobiana:

Existen diversos métodos para determinar la actividad de los agentes antimicrobianos, entre ellos tenemos:

Test de susceptibilidad por dilución:

Se utiliza para determinar la CMI y la CLM. Es un método de dilución en caldo, en donde se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antirnicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la CMI. Para medir la CLM se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.

Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del cultivo original.

Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina CLM.

Prueba de Difusión en agar:

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar Müller-Hinton y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos.

Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas.

Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas por el NCCLS.

Con esta referencia podemos informar si el micoorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibióticos ensayados en las placas.

Método de E-test:

Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.

El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación de 16-24 horas a 35ºC se observan las placas y se valora la zona de inbición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento.

Pruebas automatizadas:

La mayoría de estos novedosos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia).

Su manipulación suele ser fácil y rápida, generalmente automatizada o semiautomatizada, lo que los convierte en métodos ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de sus grandes limitaciones es que sólo ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento rápido y que no tengan requerimientos especiales.

Resistencia a los antimicrobianos:

La resistencia los antimicrobianos es uno de los mayores problemas, se define como la capacidad adquirida de un organismo para resistir los efectos de un agente quimioterapeutico al que habitualmente es sensible. La mayor parte de la resitencia es debida a genes de resistencia que se tranfieren por intercambio genético.

Algunos microorganismos pueden ser naturalmente resistentes a algunos antibióticos y existen diversas razones:

- El organismo puede carecer de la estructura que inhibe el antibiótico (carencia de pared celular).

- El organismo puede ser impermeable al antibiótico.

- El organismo puede alterar el antibiótico inactivándolo.

- El organismo puede modificar la estructura a la que es dirigido el antibiótico.

- Por un cambio genético, se pueden producir vías metabólicas que bloqueen el antimicrobiano.

- El organismo puede ser capaz de bombear hacia fuera el antibiótico que haya entrado a la célula.

Otras veces, la resistencia involucra otra serie de causas:

- Tratamientos incompletos (selección de cepas resistentes)

- Uso indiscriminado de antibióticos (flora normal resistente)

- Transferencia de genes de resistencia entre poblaciones bacterianas.

Se cual sea el mecanismo, esta resistencia está genéticamente codificada en el cromosoma o en plásmidos (plásmidos de resistencia).